Relationships between the hypothalamo-pituitary-adrenal and peptidergic systems of the hypothalamus in animals with experimental diabetes mellitus

Cover Page

Abstract


The status of the hypothalamo-pituitary-adrenal system (HPAS) and the group of regulatory neuropeptides synthesized in the zone of the medial small-cell hypothalamic subnucleus, the principal site of production of corticotropin-releasing factor, were studied in Wistar rats. HPAS was studied by radioimmunological and morpholiistochemical methods, the neuropeptidergic system by indirect immunofluorescence which helps measure the levels of neurotensin, bombesin, vasoactive intestinal peptide, leu- and met-enkeplialines, calcitonin-gene-related peptide, and cholecystokinin in the neurones and medial eminence of the hypothalamus. Development of diabetes mellitus in rats was found to be associated with an increase of HPAS activity and alteration of the peptidergic system presenting as an increase of the number of identified immunoreactive neurones and changed content of neuropeptides in neurones and of their concentration in the medial eminence.


Известно, что кортикотропин-рилизинг-фактор (КРФ) синтезируется в основном в медиальном мелкоклеточном субъядре паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ММ ПВЯ) [7]. По классическим представлениям, состояние синтетической и секреторной активности этих нейронов прежде всего зависит от уровня в крови глюкокортикоидов и АКТГ, а также ряда метаболитов, в частности глюкозы [24]. Известно также, что КРФ сам по себе является мощным регулятором аппетита [8] и секреции инсулина [20]. В последние годы показана важная роль в регуляции состояния гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС), ее центрального звена, группы регуляторных нейропептидов, синтезирующихся в нейронах ММ ПВЯ, тем более, что именно эти пептидергические нейроны содержат рецепторы к глюкокортикоидам [12]. Кроме того, установлено [10], что КРФ и ряд нейропептидов синтезируются в одних и тех же нейронах. Учитывая эти сведения, мы решили изучить взаимоотношения ГГНС и группы регуляторных нейропептидов, синтезирующихся в зоне ММ ПВЯ, при сахарном диабете у крыс линии Вистар для выяснения их возможной роли в патогенезе данного заболевания и регуляции эндокринной функции поджелудочной железы.

Материалы и методы

Исследования проведены на 36 крысах-самцах линии Вистар массой 230—250 г в осенне-зимний период. Животные находились в условиях естественного освещения, на стандартном рационе питания и были разделены на три экспериментальные группы (по 10—12 крыс в каждой): 1-я группа — контрольная, 2-я группа — животные с сахарным диабетом продолжительностью 15 дней, 3-я группа — животные с продолжительностью заболевания 36 дней. Сахарный диабет (легкое течение) моделировали при помощи введения стрептозотоцина (50 мг/кг в 0,5 мл цитратного буфера внутрибрюшинно) |1|. Контрольным животным вводили 0,5 мл нитратного буфера внутрибрюшинно. Определение глюкозы и тест толерантности, а также забой животных для извлечения органов и взятия крови проводили в 10 ч после 16часового голодания животных. Концентрацию глюкозы в крови определяли ортотолуидиновым методом. Состояние ГГНС оценивали с помощью радиоиммунологического определения в периферической крови концентраций КРФ, АКТг, кортикостерона и кортизола наборами RENINSULA LABORATORIES INC (США), CIS INTERNATIONAL (Франция), РИН-В-3Н (СНГ) и СТЕРОН-К-1251 (Беларусь) соответственно, а также по данным морфогистохимических (площади нейронов и их ядрышек и содержание в них нуклеиновых кислот) исследований нейронов ММ ПВЯ.

Для изучения системы регуляторных нейропептидов использовали метод непрямой иммунофлюоресценцин. Для идентификации иммуноположительных нейронов животным (не менее 4 из каждой экспериментальной группы) вводили 120 мкг колмшина в 20 мкл физиологического раствора на 100 г массы тела под эфирным наркозом за 48 ч до забоя с целью блокирования аксоплазматического транспорта нейропептидов в левый латеральный желудочек микроинъектором с помощью стереотаксического прибора. Контролем служили интактные животные и крысы с различными сроками заболевания сахарным диабетом, которым вместо колхицина вводили физиологический раствор в том же объеме или же проводили такую же операцию, но без введения объема жидкости. В качестве первичных антител применяли кроличьи антисыворотки к холенистокннину (ХЦК), вазоактивному интестинальному пептиду (ВИП), бомбезину (Б), нейротензину (HT), кальцитонин-ген-родственному пептиду (КГРП), лей- и мет-энкефалшу (л- и м-ЭНК) производства фирмы "Атег- sham" (Англия), а вторичных — козьи IgG, конъюгированные с FITC ("Amersham", Англия). Время инкубации серийных срезов гипоталамуса толщиной 12 мкм с первичными антителами составляло 48 ч на холоду, а со вторичными — 45 мин, после чего срезы изучали под микроскопом. Для исследования каждого пептида использовали по 5—6 срезов из различных отделов ММ ПВЯ.

Изучение распределения иммуноположительных нейронов в зоне ММ ПВЯ и их количества, определение содержания в них нейропептидов проводили на компьютерной цитофлюориметрической системе на базе микроскопа ЛЮМАМ- И2 по описанной ранее методике [1]. Содержание пептидов в нейронах, прямо пропорциональное интенсивности флюоресценции, выражали в условных микроединицах (уел. мкед).

Для морфогистохимических исследований гипоталамус крыс фиксировал! в жидкости Карнуа, а затем после стандартной гистологической обработки готовили срезы толщиной 4 мкм и окрашивали их для выявления нуклеиновых кислот галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону [4]. Изучение препаратов как в видимом спектре, так и спектре флюоресценции проводили также на компьютерной системе анализа изображения VIDAS-2.5 ("Zeiss-kontron-elektronik", Германия), связанной посредством высокочувствительной телекамеры COHU 4722 (США) с микроскопом AXIOSKOP ("Zeiss”, Германия). Все полученные данные обрабатывали статистически с применением /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

После введения животным стрептозотоцина отмечались характерные для сахарного диабета изменения в виде гипергликемии, нарушения теста толерантности к глюкозе, деструкции островков Лангерганса, гипоинсулинемии, гипер- глюкагон-гиперсоматостатинемии, описанные нами в предыдущих работах [1—3].

В ММ ПВЯ отмечалось увеличение площади нейронов и увеличение содержания в них нуклеиновых кислот (табл. 1). В плазме крови возрастала концентрация КРФ (21,51 ± 0.49 пг/мл против 19,81 ± 0,62 пг/мл в контроле; р < 0,05), АКТГ (144,6 ± 32,7 пг/мл против 58,9 ± 7,69 пг/мл в контроле; р < 0,05), кортикостерона (271,4 ± 34,0 Пг/мл против 72,8 ± 4,56 пг/мл в контроле; р < 0,001) и кортизола (14,86 ± 0,88 нг/мл против 9,95 ± 1,17 нг/мл в контроле; р < 0,001). Таким образом, при развитии сахарного диабета повышалась активность ГГНС, что отмечено и другими авторами в условиях как эксперимента, так и клиники [15, 22].

 

Таблица 1

Морфогистохимические показатели состояния нейросекреторных клеток ММ ПВЯ при сахарном диабете ± т)

Ядра гипоталамуса

Контроль

Диабет

15 дней

36 дней

ММ ПВЯ:

 

 

 

клетка

63,9 + 1,25

82,9 ± 0,79**

81,3 ± 0,74**

738,4 ± 13,2

978,5 ± 18,4**

836,1 ± 20,0**

ядрышко

2,34 ± 0,13

1,89 ± 0,08*

2,39 + 0,11

75,0 ± 1,13

86,4 ± 1,48**

73,4 ± 1,23

Примечание. В числителе — морфометрические показатели, в знаменателе — содержание нуклеиновых кислот. Здесь и в табл. 2 достоверность различий к контролю: одна звездочка — р < 0,005, две — р < 0,001.

 

Вместе с тем обращали на себя внимание особенности состояния ГГНС в этих условиях, которые проявлялись в том, что, несмотря на высокий уровень глюкокортикоидов и АКТУ. торможения активности КРФ-синтези- рующих нейронов не наблюдалось. Не влияло на состояние ГГНС и развитие гипергликемии, которая, как известно, также тормозит секрецию КРФ в гипоталамусе [24]. Особенности состояния ГГНС при сахарном диабете у экспериментальных животных и людей в виде нарушения чувствительности центральных звеньев этой системы как к стимулирующим, так и к угнетающим влияниям отмечены и другими авторами [9, 17]. Вместе с тем, при данной патологии, как показано рядом исследователей, возрастает чувствительность ГГНС к другим стимулирующим влияниям, например, к окситоцину [25]. Анализ наших собственных данных и литературных сведений о состоянии ГГНС при сахарном диабете позволяет предположить, что в условиях сахарного диабета изменяется принцип функционирования ГГНС и в регуляцию ее состояния включаются новые факторы, например, катехоламины и пептидергическая система. Подтверждением этого предположения стали результаты наших исследований нейропептидов в зоне ММ ПВЯ.

Без предварительного введения колхицина пептидсодержащие нейроны не идентифицировались. На этот процесс не влияли также операция или введение в латеральный желудочек физиологического раствора. После введения колхицина у интактных животных в зоне ММ ПВЯ в количественном отношении преобладали ХЦК-иммуноположительные нейроны (табл. 2), а максимальное содержание в клетке нейропептида было характерно для НТ.

У животных 2-й экспериментальной группы с длительностью заболевания 15 дней реакция пептидергической системы в зоне ММ ПВЯ была неоднозначной. Значительно возрастало количество идентифицированных НТ и КГРП-им- муноположительных нейронов, хотя содержание в них самих нейропептидов достоверно уменьшалось (см. табл. 2). В то же время концентрация этих нейропептидов в срединном возвышении гипоталамуса, так же как и количество иммунореактивных волокон, значительно возрастало, отражая процесс активной их секреции из нейронов. Количество идентифицированных ХЦК-, л-ЭНК и Б-иммуноположительных нейронов в этот период уменьшалось, а м-ЭНК и ВИП-иммуноположительных нейронов практически не изменялось. При этом содержание в клетках этих нейропептидов достоверно увеличивалось, так же как количество иммунореактивных волокон в срединном возвышении и концентрация в них нейропептидов.

Дальнейшее развитие сахарного диабета вызывало к 36-му дню значительное (в несколько раз) увеличение количества идентифицированных иммуноположительных нейронов, содержащих изучаемые нейропептиды, по сравнению как с контролем, так и с предыдущим сроком (см. табл. 2). Однако содержание в клетках нейропептидов в основном снижалось, за исключением уровня л-ЭНК и Б, который был достоверно увеличен по сравнению с контролем, но не с предыдущим сроком развития диабета. В срединном возвышении снижалась концентрация НТ, КГРП и ХЦК, по сравнению с предыдущим сроком, оставаясь достоверно выше, чем в контроле. Концентрация же л-, м-ЭНК и Б в срединном возвышении увеличивалась еще в большей степени, отражая процесс активной секреции этих пептидов.

 

Таблица 2

Содержание нейропептидов в нейронах ММ ПВЯ (1) и срединном возвышении (2) гипоталамуса крыс ± т)

Нейропептид

Контроль

Диабет

15 дней

36 дней

1

2

■            1               I            -2

 

2

НТ

1369, 5 ±25, 8

762, 3± 18,3

1072, 3 ± 15,2**

1387,0 ±19,9**

992,4 ± 19, 3**

805,7 ±17,3

170

47

570

291

529

123

КГРП

1057,9 ±26, 6

452, 9 ±31, 8

906,6 ±16, 8**

1477,0 ±25,0*

930,2 ±12, 1**

992,0 ±26,4**

139

34

328

171

824

64

хцк

987,9 ± 17, 6

365, 5 ±20,6

1194,6 ±29,2**

1142, 3±28, 5**

988,2 ± 12,4

589,8 ±20,1**

422

29

243

171

895

87

л-ЭНК

986,3 ±20, 6

349, 4 ± 15,9

1206,2 ±23,9**

1123,6 ±32, 4**

1092, 4 ±20,3**

1337,0 ±16,1**

249

31

191

105

621

94

м-ЭНК

883, 8 ±23, 6

548, 8 ± 17,5

1192,9 ±30,3**

1160,6 ±17,41**

691,0 ±14,0**

1484,0 ±20, 9**

195

44

205

105

309

141

Б

893,1 ± 19,1

451, 5 ±25,1

1247,3 ±26,0**

1646, 3 ± 39,6**

1006, 3 ± 15,5**

1542,9 ±35,4**

219

46

162

154

591

75

вип

936,4 ±24,7

469, 4 ±27,2

1074,1 ±24, 3**

1744, 6 ±32,4**

892,4 ± 19, 5

1396,0 ±27,9**

181

29

171

124

335

56

Примечание. В числителе — содержание нейропептидов (в усл. мкед), в знаменателе — количество идентифицированных нейронов и иммунореактивных волокон.

 

Проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что развитие сахарного диабета характеризуется повышением активности ГГНС на всех уровнях. При этом в процесс регуляции ее центрального звена — КРФ-синтсзируюших нейронов, а также передней доли гипофиза — активно вовлекается пептидергическая система гипоталамуса, о чем свидетельствуют приведенные выше данные.

Возникает естественный вопрос о значении выявленных нами изменений ГГНС и пептидергической системы гипоталамуса.

В работах S. СессаТеШ и соавт. |10] показано, что изучаемые нами нейропептиды локализованы преимущественно в КРФ-синтезирующих нейронах ММ ПВЯ, что уже само по себе предполагает их участие в регуляции состояния ГГНС. Кроме того, установлено [14, 18, 19], что нейроны ММ ПВЯ, в которых идентифицируются л- и м-ЭНК, ВИП, КГРП, нейротензин, направляют свои аксоны в наружную и в меньшей мере во внутреннюю зоны срединного возвышения, откуда пептиды попадают в переднюю долю гипофиза, принимая участие в регуляции его гормональной функции. В частности, волокна, содержащие энкефалины и КГРП, имеют тесные контакты с кортикотропоцитами гипофиза |14, 19], что свидетельствует об их роли в регуляции секреции АКТГ. С другой стороны, эти факторы могут самостоятельно или опосредовано оказывать влияние на процессы, имеющие отношение к регуляции углеводного обмена и эндокринной функции поджелудочной железы.

Известно, что в условиях нормы основными регулятором функции В-клеток являются глюкоза и некоторые аминокислоты. Влияние же других факторов, таких, как нервная и эндокринная система, нейропептиды и медиаторы, невелико. Однако в условиях патологии (сахарный диабет) и действия чрезвычайных факторов (стресс) их эффекты значительно возрастают, что подчеркиваю!' в своих обзорах В. П. Федотов и соавт. [5], Е. Widmaier |26], а также показано в наших работах |4, 5]. При этом они могут действовать на процессы синтеза и секреции инсулина, на его взаимодействие с рецепторами, на метаболизм глюкозы и липидов, а также синтез и секрецию контринсулярных гормонов. О возможной роли нейропептидов в регуляции ГГНС мы уже говорили выше. Однако эффекты КРФ не ограничиваются его влиянием на переднюю долю гипофиза. ' Данные литературы показывают [8, 20], что этот нейрогормон является мощным регулятором аппетита и обладает способностью стимулировать секрецию инсулина. Установлено [11], что КГРП, синтезируясь в ММ ПВЯ, оказывает влияние на синтез АКТГ и СТГ в аденогипофизе. При этом данный нейропептид вызывает развитие инеулинорезистентности, а также ряд контринсулярных эффектов, характерных для глюкокортикоидов. Такие пептиды, как ВИП, ХЦК, м-ЭНК, могут оказывать прямое стимулирующее действие на секрецию инсулина [6, 11, 16], а НТ аналогичное действие может осуществлять через n. vagus [13], влияния которого на состояние В-клеток хорошо известны. В свою очередь Б оказывает защитное действие на В- клетки в ответ на влияние диабетогенных факторов как m vivo, так и in vitro [21].

Следовательно, реализация эффектов нейропептидов на уровне гипоталамуса и гипофиза, а также на уровне периферии может иметь своим следствием развитие как патологических, так и компенсаторных механизмов при сахарном диабете, знание которых в перспективе позволит использовать эти факторы с целью коррекции данного заболевания.

Выводы

  1. Развитие экспериментального сахарного диабета характеризуется повышением активности ГГНС, что проявляется гипертрофией нейронов ММ ПВЯ и их ядрышек, а также увеличением в г крови концентрации КРФ, АКТГ и глюкокортикоидов.
  2. У животных с экспериментальным сахарным диабетом отмечаются выраженные изменения состояния пептидергической системы в зоне ММ ПВЯ и срединном возвышении гипоталамуса, что свидетельствует об ее участии в патогенезе данного заболевания.

*Изучение распределения нейропептидов у животных выполнено по гранту N UDE000 Международного научного фонда Дж. Сороса.

Yu. M. Kolesnik

Zaporizhzhia State Medical University

Author for correspondence.
Email: probl@endojournals.ru

Russian Federation

A. V. Abramov

Zaporizhzhia State Medical University

Email: probl@endojournals.ru

Russian Federation

O. V. Melnikova

Zaporizhzhia State Medical University

Email: probl@endojournals.ru

Russian Federation

  1. Колесник Ю.М., Василенко Г.В., Абрамов А.В. // Арх. пат. - 1992. - Т.54. - №12. - С.24-27.
  2. Колесник Ю.М., Абрамов А.В. // Пробл. эндокринол. — 1993. - Т.33. - №5. - С.37-40.
  3. Колесник Ю.М., Орестенко Ю.Н., Абрамов А.В. // Пробл. эндокринол. - Т. 39. - №1. — С.45-48.
  4. Колесник Ю.М., Орестенко Ю.Н., Абрамов А.В. // Физи- ол. журн. им. И. М. Сеченова. — 1993. - Т.79. - №9. — С.34-41.
  5. Колесник Ю.М., Абрамов А.В. // Укр. биохим. жури. — 1993. - Т.65. - № 3. — С.99-104.
  6. Федотов В.П., Садовникова Н.В., Чернушкина А.В. // Пробл. эндокринол. — 1992. — Т. 38. - № 5. — С. 12-17.
  7. Antoni F.A., Fink G, Sheward W.J. // J. Endocr. — 1990. — Vol.125. - №2. - P.175-183.
  8. Arase K., Shargill N. S., Bray G. A. // Amer. J. Physiol. — 1989 - Vol.255, N 3. - P. R751-R756.
  9. Bellush L. L., Henley W. N. // Physiol. Behav. — 1990. — Vol.47, N 2. - P.231-238.
  10. Ceccatelli S., Eriksson Ml., Hokfelt T. // Nenroendocrinology. - 1989. - Vol.49. - P.309-323.
  11. Choi S. B., Frontoni S., Sloan L. et al. // Diabetologia. — 1990 - Vol. 33. - Suppl. - P. 113.
  12. Cintra A., Fuxe K, Sofsini V. et al. // J. Steroid Biochem. — 1991- Vol. 40, N1-3. - P.93-103.
  13. Duan Shu-Min, Shimizu Nobuaki // Acta Physiol, sin. — 1992. - Vol. 44, N5. - P.427-433.
  14. Gond J. U., Zhang X. U. // J. comp. Neurol. — 1992. — Vol. 325, N 1. - P. 101-111.
  15. Guillaume-Gentil C., Rohner-Jeanrenaud F., Jeanrenaud B., et al. // Diabetologia. — 1989. - Vol. 32, N 7. - P.494A.
  16. Karlsson S., Ahren B. // Acta physiol, scand. — 1991. — Vol. 2. - P. 397-403.
  17. Kopelman P. G., Grossman A., Lavender P. et al. // Clin. Endocr. - 1988. - Vol. 28, N1. - P.15-18.
  18. Larsen P. J., Mikkelsen J. D. // J. comp. Neurol. — 1992. — Vol. 326, N2. - P.189-192.
  19. Merchenthaler I. // Ibid. — N1. — P.112-120.
  20. Rohner-Jeanrenaud F., Jeanrenaud B. // Neuroendocrinology. - 1990. - Vol. 52, N 1. - P.52-56.
  21. Song Yu, Yu Ji-Ren // Acta physiol, sin. — 1991. — Vol. 43, N4. - P.428-435.
  22. Tsigos C, Crosby S., Gybson S. et al. // Diabetologia. — 1989. - Vol. 32, N7. - P.550A.
  23. Uah M.A., Straub S., Ierspohl E.J. // Ibid. — 1991. — Vol. 34. — Suppl. 2. — P.64.
  24. Widmaier E.P., Plotsky P.M., Sutton S.W., Vale W.W. // Amer. I. Physiol. - 1988. - Vol. 225, N 3, Pt 1. - P.287-292.
  25. Widmaier E.P., Shah P R., Lee G. // Regul. Peptid. — 1991. Vol.34, N3. - P.233-249.
  26. Widmaier E.P. // Molec. cell. Endocr. — 1991. — Vol.75, N1. - P.C1-C6.

Views

Abstract - 11

PDF (Russian) - 12

Cited-By


PlumX

Dimensions


Copyright (c) 1996 Kolesnik Y.M., Abramov A.V., Melnikova O.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies