Перейти к:
Изучение полиморфизма гена тиреоглобулина щитовидной железы человека
Аннотация
Основной целью данной работы были проведение популяционно-генетического анализа ПДРФ, выявляемого в гене ТГ, и отработка системы молекулярно-генетических исследований наследственных заболеваний щитовидной железы, связанных с полинуклеотидными перестройками в структуре ТГ. Проведен популяционно-генетический анализ ПДРФ, выявлялемого в гене ТГ. При расщеплении образцов крови здоровых жителей Ташкента рестриктазами EcoRV и Taql были обнаружены 2 пары альтернативных вариантов нормального ПДРФ — 13,8 или 8,5 и 5,8 или 6,2 т. п.н. соответственно. С целью выявления ПДРФ в гене ТГ при врожденном гипотиреозе проанализированы образцы ДНК 2 семей (мать, отец, дочь) с клиническим диагнозом врожденного гипотиреоза и обнаружены те же варианты ПДРФ, что и у здоровых индивидуумов.
Для цитирования:
Кадырова Д.А., Атаханова Б.А., Рахимова М.Л., Умарова Г.Д., Туракулов Я.X. Изучение полиморфизма гена тиреоглобулина щитовидной железы человека. Проблемы Эндокринологии. 1996;42(5):34-36.
For citation:
Kadyrova D.A., Atakhanova B.A., Rakhimova M.L., Umarova G.D., Turakulov Ya.Kh. Study of human thyroglobulin gene polymorphism. Problems of Endocrinology. 1996;42(5):34-36. (In Russ.)
Врожденные аномалии тиреоидного метаболизма могут привести к замедлению роста и умственного развития, поэтому для обнаружения заболевания на начальной стадии и своевременного лечения необходима программа скрининга новорожденного. Около 3—5% случаев врожденного гипотиреоза обусловлены дефектом синтеза или структуры основного белка щитовидной железы тиреоглобулина (ТГ).
ТГ — йодсодержащий гликопротеин, в составе которого осуществляется биосинтез тиреоидных гормонов. Нативный ТГ состоит из 2 идентичных 128-субъединиц с мол. массой по 330 кД, кодируемых 33S мРНК. мРНКур — одна из самых больших мРНК, описанных у млекопитающих; ее мол. масса составляет 2,8 • 10б Д. В последние годы ТГ стал объектом молекулярно-биологических исследований: на матрице мРНКТр удалось синтезировать 2-нитевую кДНК полной длины, т. е. получить полный структурный ген ТГ [9].
Протяженность гена ТГ более 300 т. п.н. В геноме человека ген ТГ представлен 1 копией. Он содержит не менее 37 экзонов, разделенных интронами. Между 51- и 3 ^областями гена ТГ обнаружены значительные структурные различия: все экзоны, кодирующие З1-область мРНК, примерно одинакового размера (100—200 т. п.н.), в З^об- ласти среди экзонов одинакового размера имеются экзоны размером 1120 и 560 п.н.; в З^области обнаружены интроны размером 64 т. п.н., в то время как размеры интронов 5 ^концевого сегмента не превышают 8 т. п.н. [5].
Вследствие большого размера гена ТГ ожидается, что он подвержен значительному числу инактивирующих мутаций. Природа дефектов в гене ТГ при наследственных заболеваниях щитовидной железы человека неизвестна, поэтому молекулярно-генетические исследования этих заболеваний основаны на семейном анализе распределения нормальных полиморфных участков узнавания рестриктаз, т. е. на изучении нормального полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). В последние годы в литературе обсуждаются перспективы изучения ПДРФ для диагностики наследственных заболеваний щитовидной железы [3, 4].
Основной целью данной работы были проведение популяционно-генетического анализа ПДРФ, выявляемого в гене ТГ, и отработка системы молекулярно-генетических исследований наследственных заболеваний щитовидной железы, связанных с полинуклеотидными перестройками в структуре ТГ.
Tg-gene s'
СНТ 16 > Ч Ч Ч Ч 2 2 !Ц- 9.
рент 16 ? — ? 2 2
в,о 3,2
Рис. 1. Организация 5'-конца гена ТГ.
Рестриктная карта космидного клона и (рестриктаза EcoRI).
Материалы и методы
ДНК из лейкоцитов человека выделяли методом фенольной экстракции [2]. Рестрикционный анализ проводили с помощью рестриктаз BamHI, Hindi!], EcoRI, EcoRV, MstI, Pvull (НПО "Фермент", Вильнюс). Фрагменты ДНК (1 мкг на пробу) разделяли методом электрофореза в 0,8% агарозном геле по методу Р. Sharp и соавт. [7]. Перенос ДНК из геля на нейлоновые фильтры ’’Biodan'' осуществляли по методу Е. Southern [8]. Введение радиоактивной метки в ДНК проводили методом нуклеотидного замещения радиоактивной метки в ДНК по Р. Riqby и соавт. [6] с помощью ДНК-полимераз E.coli. Гибридизацию проводили с меченными 32Р ДНК вышеуказанных клонов (удельная активность 107—108 cpm/мкг) в течение 18 ч при 65°С в смеси, содержащей 4Х ССР, 4-крат- ный раствор Денхарта, 0,5 мг/мл поли (У), 0,1% SDS, 5% декстрансульфата. После гибридизации фильтры тщательно отмывали и подвергали авторадиографии в течение 5—15 дней при —70’С, используя пленку РМ-1 и усиливающие экраны.
Результаты и их обсуждение
Ген ТГ человека картирован в длинном плече хромосомы 8 в области полосы q24, что было подтверждено как гибридизацией in siti, так и блот- анализом по Саузерну соматических клеток гибридов человек — грызун [4].
Для изучения ПДРФ были использованы зонды, охватывающие З'-конец гена ТГ (рис. 1).
В исследованиях заболеваний большое значение имеет определение гетерозиготного носительства, т. е. выявление в популяции индивидуумов, у которых нет данного заболевания, но они гетерозиготны по рецессивной мутации, которая способна выявить эту болезнь.
При расщеплении образцов ДНК крови здоровых жителей Ташкента рестриктазами EcoRV и Taql с последующим блот-анализом были обнаружены 2 пары альтернативных вариантов нормального ПДРФ — 13,8 или 8,5 и 5,8 или 5,2 т. п.н. соответственно (рис. 2). Для каждого фермента было тестировано по 40 индивидуумов. В табл. 1 приведены распределения генотипов по рестрикционным полиморфным сайтам EcoRV и Taql в гене ТГ здоровых доноров — жителей Ташкента.
Частота встречаемости EcoRV- и Taql-полиморфизма в гене ТГ составила 33 и 21% соответственно (табл. 2).
Рис. 2. Авторадиограф образцов ДНК из донорской крови, обработанных рестрик- тазами EcoRV (а) и Taql (о).
Рис. 3. Авторадиограф образцов ДНК из крови больных, обработанных рестрикта- зами EcoRV (а) и Taql (б).
а: 1 — норма, 2 — отец, 3 — дочь, 4 ~ мать; о: 7 — мать, 2 — норма, 3 — отец, 4 — дочь.
Для исследования ПДРФ в гене ТГ при врожденном гипотиреозе были проанализированы образцы ДНК 2 семей (мать, отец, дочь) с клиническим диагнозом врожденного гипотиреоза. Найдены 2 пары альтернативных вариантов ПДРФ, выявляемых при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами (EcoRV-зондом рсНТ 16/ 3,2 и Taql-зондом рсНТ 16/8,0 в зависимости от присутствия или отсутствия полиморфного сайта) — 13,8 или 8,5 и 5,8 или 5,2 т. п.н. (рис. 3).
Как известно, наличие у человека той или иной формы ПДРФ — характеристика чисто вероятностная; чем больше вариантов ПДРФ, связанного с данным геном, имеется в данной популяции, тем больше вероятность того, что удастся подобрать нужную рестриктазу. В этом отношении ген фенилаланингидроксилазы оказался весьма удачным. Частота встречаемости ПДРФ в гене фенилаланингидроксилазы составляет более 80%, что обеспечивает возможность диагностики фе-
Таблица 1
Распределение генотипов в гене ТГ здоровых жителей Ташкента
ПДРФ Генотип Популяция
EcoRV + + 37
+ - 13
0
40
Taql + + 32
+ - 8
0
40
Примечание. + присутствует сайт рестрикции, — отсутствует сайт рестрикции.
нилкетонурии в абсолютном большинстве семей с возможным риском данного заболевания [1]. В случае заболеваний щитовидной железы ПДРФ оказался неожиданно редким, что ограничивает круг семей, в которых возможна диагностика. Так, при средней частоте замен и нуклеотидов в рамках нормального полиморфизма, составляющей примерно 1 замену на 100—200 п.н., в случае гена ТГ из "прозондированных" с помощью большого набора рестриктаз 1164 п.н. полиморфизм наблюдался лишь в 1 случае с очень низкой частотой — около 2% [2].
ПДРФ обнаруживается в 51- и З1-областях гена ТГ с разной частотой. Если в З-концевой области выявлен всего лишь 1 редко встречаемый ПДРФ, то в 5^области выявлены 2 высокоповторяемых ПДРФ. Частота встречаемости EcoRV и Taql ПДРФ составила 15 и 20% соответственно. Эти 2 высокочастотных ПДРФ в 51-части гена могут быть использованы для исследования не только врожденных аномалий синтеза ТГ, но и сцепления в области теломеры хромосомы 8q [4].
Наши результаты, а также данные об обнаружении 2 высокочастотных ПДРФ в 5^области гена ТГ дают возможность использовать ПДРФ в
Таблица 2
Частота полиморфных сайтов рестрикции в гене ТГ здоровых жителей Ташкента
ПДРФ Показатель Популяция
EcoRV р 0,33 ± 0,04
Q 0,67
N 40
Taql Р 0,21 ± 0,06
q 0,79
N 40
Примечание, р и q — частота положительных и отрицательных сайтов рестрикции соответственно, N — число случаев. качестве маркера для исследования врожденных аномалий синтеза ТГ, а в дальнейшем и для ДНК-диагностики этих заболеваний.
Выводы
1. Проведен популяционно-генетический анализ ПДРФ, выявлялемого в гене ТГ. При расщеп- * лении образцов крови здоровых жителей Ташкента рестриктазами EcoRV и Taql были обнаружены
2 пары альтернативных вариантов нормального ПДРФ — 13,8 или 8,5 и 5,8 или 6,2 т. п.н. соответственно.
2. С целью выявления ПДРФ в гене ТГ при врожденном гипотиреозе проанализированы образцы ДНК 2 семей (мать, отец, дочь) с клиническим диагнозом врожденного гипотиреоза и обнаружены те же варианты ПДРФ, что и у здоровых индивидуумов.
Список литературы
1. Калинин В. Н. // Достижения в молекулярной генетике. Достижения современной генетики и перспективы их использования в медицине. — М., 1987. — С. 38—48.
2. Шипицина Г. И., Луни, М. Г., Шифтер К. А. и др. // Генетика. - 1980. — № 1. — С. 78-85.
3. Baas Е, Bikker Н., van Оттеп G. J., de Vijlder J. J. M. // Hum. Genet. - 1984. - Vol. 67. - P. 301-305.
4. Baas F., Bikker H., Geurts A. et al. // Ibid. — 1985. — Vol. 69. - P. 138-143.
5. Baas F., van Оттеп H., Bikker A. et al. // Nucl. Acids Res. — 1986. - Vol. 14. — P. 5171—5186.
6. Rigby P. W. J., Diecman M., Ponders G., Berg P. // J. Mol. Biol. — 1977. — Vol. 113. - P. 237-251.
7. Sharp P. A., Sugden B., Sambrook J. // Biochemistry. — 1973. - Vol. 12. — P. 3055—3063.
8. Southern E. M. // J. Mol. Biol. - 1975. - Vol. 98. - P. 503- 517.
9. Vassart G., Brocas H., Lecocg E., Dumont E. // Eur. J. Biochem. - 1975. - Vol. 55. - P. 15-22.
Об авторах
Д. А. КадыроваУзбекистан
Б. А. Атаханова
Узбекистан
М. Л. Рахимова
Узбекистан
Г. Д. Умарова
Узбекистан
Я. X. Туракулов
Узбекистан
Рецензия
Для цитирования:
Кадырова Д.А., Атаханова Б.А., Рахимова М.Л., Умарова Г.Д., Туракулов Я.X. Изучение полиморфизма гена тиреоглобулина щитовидной железы человека. Проблемы Эндокринологии. 1996;42(5):34-36.
For citation:
Kadyrova D.A., Atakhanova B.A., Rakhimova M.L., Umarova G.D., Turakulov Ya.Kh. Study of human thyroglobulin gene polymorphism. Problems of Endocrinology. 1996;42(5):34-36. (In Russ.)