The effect of hypercaloric diet and Quercetin on the full-transcriptome liver tissue profile of Zucker-LEPRfa rats

Cover Page

Abstract


BACKGROUND: The peptidic hormone leptin (Lep) occupies a central place in the control of energy homeostasis and body weight in mammals. A convenient model for studying the role of impaired Lep reception is the Zucker-LEPRfa rats, which carry a mutation in the homozygote of the LEPR gene. Quercetin (Q; 3.3 ‘, 4’, 5.7-pentahydroxyflavone) is currently being considered as one of the promising biologically active substances, which allows to correct metabolic disorders in obesity and metabolic syndrome.

AIM: to study changes in the expression of genes in liver tissue of rats with impaired receptivity of Lep under the influence of high-fat and high-carbohydrate diet (HFCR) or/and Q supplementation.

MATERIAL AND METHODS: 4 groups of six male Zucker-LEPRfa male rats were used in experiment. Within 61 days the animals of the 1st group (control) received a balanced semi-synthetic diet, the second group received the same diet with the addition of quercetin in a dose of 50 mg/kg of body weight, the third group — the HFCR (30% fat by dry weight and 20% fructose instead of water), the 4th group is the same diet and supplement of quercetin. Full transcriptional profiling of liver tissue was performed on microchips from the Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies), a real-time polymerase chain reaction combined with reverse transcription (RT-PCR) was performed for liver transcripts of Crot, FTO, NpY, Prdx1, Prom1, Ugt2b37 and GAPDH genes contained in liver tissue.

RESULTSIt was shown that feeding of Zucker-LEPRfa rats with Q and/or HFCR led to significant changes in the level of transcription of 1604 genes in liver tissue, from which the effect of quercetin proper was manifested for 1396 genes. Changes were more pronounced in the transcriptome of liver tissue caused by HFCR, than caused by the addition of Q against the background of a standard diet. Q influenced the expression of genes responsible for xenobiotic detoxification processes (UGT2b37), redox homeostasis (Prdx1), beta-oxidation of fatty acids (Crot), and central mechanisms affecting hunger and satiety (NpY), and potentiated, or abolished the effects of HFCR against a number of other functionally important genes. Bioinformatic analysis revealed the influence of HFCR and/or Q on 23 metabolic pathways (KEGGS), of which 7 (the metabolism of steroids, arachidonic and linoleic acids, retinoids, drugs and xenobiotics (due to cytochrome P-450), bile secretion) were affected in all experimental groups.

CONCLUSIONS: Changes in the transcriptome of the liver of Zucker-LEPRfa rats, caused by consumption of HFCR and/or Q, were consistent with experimental data on changes in short-term memory, anxiety and mineral metabolism in these animals.


Full Text

Обоснование

Поддержание гомеостаза энергии у человека и млекопитающих в условиях разнообразного питания осуществляется при участии нейрогуморальной регуляции потребления пищи со стороны центральной нервной системы (ЦНС). В литературе рассматриваются два контура такой регуляции, включая «гомеостатический», опосредуемый реакцией нейронов дугообразных ядер гипоталамуса на поступающие от периферических тканей гормональные сигналы, такие, как адипокины — лептин (Lep) и грелин [1, 2], и «гедонистический», сосредоточенный в высших отделах головного мозга, непосредственно связанных со вкусовым анализатором, и реализуемый при участии каннабиноидных и опиоидных рецепторов, а также их эндогенных лигандов [3]. Поломки этих регуляторных механизмов могут вызвать дисрегуляцию чувства голода и насыщения, приводящую к развитию алиментарного ожирения и метаболического синдрома. Взаимодействие обоих регуляторных контуров имеет сложный характер, в частности, важную роль в нем может играть развитие системного воспаления [4].

Lep, секретируемый адипоцитами белой жировой ткани, занимает центральное место в контроле энергетического гомеостаза и массы тела. Гематоэнцефалический барьер частично проницаем для Lep, что приводит к его поступлению в гипоталамус и связыванию с его специфическим рецептором LEPR [5] с последующей активацией сигнального каскада SOCS3 [6]. По мере накопления жировых запасов уровень циркулирующего Lep повышается, он проникает в гипоталамус в большем количестве, стимулируя POMC-нейроны и ингибируя NPY/AgRP-нейроны [1]. В норме Lep у млекопитающих оказывает анорексигенное, катаболическое, липолитическое и гипогликемическое действие, благодаря которому формируется механизм отрицательной обратной связи. При ожирении действие Lep нарушается вследствие ослабления его нормального переноса через ГЭБ, или связывания с циркулирующей в крови формой рецептора [7].

Удобной моделью для изучения роли нарушенной рецепции Lep при ожирении являются крысы Zucker-LEPRfa, несущие в гомозиготе мутацию гена LEPR, делающую соответствующий рецептор нефункциональным. В результате у этих животных, с одной стороны, отсутствует влияние запасов жира на объем потребляемой пищи, что приводит к быстрому развитию ожирения даже при потреблении стандартного сбалансированного рациона. С другой стороны, нарушение процессов рецепции и интернализации Lep клетками ослабляет его клиренс, что приводит к резкому повышению уровня этого гормона в крови и развитию не свойственных ему в норме иммунотропных эффектов, обусловленных частичной гомологией структуры Lep и ряда цитокинов и хемокинов [8, 9]. В органах и тканях таких животных меняется экспрессия большого числа генов, отвечающих за функционирование разнообразных метаболических путей, определяющих гомеостаз организма. Эти изменения в значительной степени соответствуют таковым у больных с алиментарным ожирением.

В качестве перспективных средств, позволяющих осуществлять коррекцию указанных нарушений, в настоящее время рассматриваются минорные биологически активные вещества, принадлежащие к группе биофлавоноидов, в частности кверцетин (Q; 3,3’,4’,5,7-пентагидроксифлавон). Согласно ряду экспериментальных данных [10, 11] и клинических наблюдений [12], Q в дозах, характерных для его содержания в пищевых продуктах, смягчает проявления метаболического синдрома, вызванного потреблением избытка легкоусвояемых углеводов. Предполагается, что действие Q связано с активацией транскрипционных факторов PPAR-γ, SREBP1 и AMPk [13]. Эффективность Q в плане коррекции ожирения и побочных иммунотропных влияний при нарушенной рецепции Lep исследована недостаточно.

Цель исследования — изучить изменения в экспрессии генов в ткани печени крыс Zucker-LEPRfa под влиянием рациона с избыточной энергетической ценностью и/или добавки к рациону Q методами анализа полнотранскриптомного профиля на мультивалентных ДНК-микрочипах с биоинформатическим анализом получаемых данных в среде «R», а также методом от-ПЦР в «реальном времени».

Материал и методы

Исследования проведены на 24 самцах крыс (возраст 8–10 нед, средняя исходная масса тела 176±7 г) линии Zucker-LEPRfa, полученных из питомника «Charles River», Италия. Правила работы с животными соответствовали Приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации №193 н от 01.04.16 «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Экспериментальный дизайн был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (протокол №4 от 20.04.17). Животные были разделены на четыре группы равной численности (n=6). В течение 61-х суток животные 1-й группы (контроль) получали сбалансированный рацион по AIN93M, 2-й группы — такой же рацион с добавкой Q в дозе 50 мг/кг массы тела, 3-й группы — высокожировой рацион (30% жиров по массе сухих веществ) и 20% фруктозы вместо воды (ВУВЖД), 4-й группы — такой же рацион с добавкой Q. Рацион и питьевые жидкости предоставляли животным в режиме неограниченного свободного доступа. Крыс содержали по 2 особи в клетках из поликарбоната при 12/12 часовом режиме освещенности и температуре воздуха 22±1 °С. Ежедневно фиксировали количество съеденного корма и выпитой жидкости и рассчитывали потребленную энергетическую ценность рациона. Массу тела определяли еженедельно на электронных весах с точностью ±1 г.

Выведение животных из эксперимента осуществляли на 62-е сутки путем декапитации под эфирной анестезией. Кровь собирали в пробирки с 1,0% раствором гепарина в 0,15 М NaCl (1:10 по объему), плазму отделяли центрифугированием и проводили исследование биохимических показателей на анализаторе Konelab 20i (Финляндия). Печень отбирали стерильными хирургическими инструментами из нержавеющей стали, немедленно охлаждали на льду до температуры 0–2 °С, взвешивали с точностью ±0,01 г и хранили до исследования при –80 °С.

мРНК из ткани печени выделяли с использованием набора Agilent Total RNA Isolation Mini Kit («Agilent Technologies», США). Навеску 20 мг замороженной ткани печени быстро гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера–Эдельвейма в 500 мм3 лизирующего буфера (с добавлением 5 мм3 β-меркаптоэтанола на 500 мм3 буфера) при температуре 0–2 °С. Дальнейшие процедуры проводили в соответствии со стандартным протоколом [14]. Полученную общую РНК дополнительно обрабатывали ДНК-азой I для удаления следов геномной ДНК. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 1000, после чего разбавляли ее водой без нуклеаз до концентрации 200 нг/мм3 и проводили анализ степени фрагментации на Agilent Bioanalyzer 2100 с определением показателя RIN (RNA Integrity Number показатель целостности РНК). РНК хранили в воде, свободной от нуклеаз, или в виде изопропанольных осадков при –80 °С. кДНК на основе тотальной мРНК синтезировали с помощью набора Agilent AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit («Agilent Technologies», США), согласно протоколу производителя.

Полнотранскриптомное профилирование ткани печени выполняли на микрочипах из набора Gene Expression Hybridization Kit («Agilent Technologies»), по протоколу Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis Low Input Quick Amp Labe ling, version 6.8 [15]. Сканирование микрочипов выполняли на приборе SureScan Microarray Scaner, производства «Agilent Technologies». Величину экспрессии выражали в виде логарифма по основанию 2 (logFC) возрастания или убывания флуоресценции по сравнению с контрольной группой. Всего для каждого образца кДНК были получены данные для дифференциальной экспрессии 30 003 генов, представленных на микрочипе.

Полимеразную цепную реакцию в «реальном времени», совмещенную с обратной транскрипцией ( ОТ-ПЦР) для содержащихся в ткани печени транскриптов генов Сrot, FTO, NpY, Prdx1, Prom1, Ugt2b37 и GAPDH, проводили на приборе CFX96 («Bio-Rad», США) в объеме 25 мкл реакционной смеси, включавшей следующие компоненты: 10х буфер для TaqPol (cодержит 2 мМ MgCl2; «Евроген», Россия) — 2,5 мкл; (R+F) праймеры (10 мкМ; «ДНК-Синтез», Россия) — 1 мкл; зонд (10 мкМ; «ДНК-Синтез», Россия) — 0,5 мкл; смесь dNTPs (5 мМ; «СИбЭнзим», Россия) – 0,5 мкл; вода без ДНКаз и РНКаз «TermoScientific», США) – 18,5 мкл; Taq-полимераза (5 ед/мкл; «Евроген», Россия) — 0,5 мкл и кДНК (400 нг/мкл) — 1 мкл. На первом этапе Taq-полимеразу активировали 3 мин при 95 °С, затем проводили 45 циклов амплификации (95 °С — 15 с, 60 °С — 1 мин). Величину экспрессии выражали в единицах логарифма по основанию 2-го отношения к количеству мРНК конститутивного гена β-актин.

Статистическую обработку результатов выполняли согласно непараметрическому ранговому критерию Манна–Уитни. Достоверность изменения дифференициальной экспрессии генов оценивали путем анализа логарифмов интенсивности флуоресценции, нормализованных по внутренним контролям (Spike-In), с использованием Т-теста с множественной коррекцией Benjamini–Hochberg [16]. Для расчетов применяли пакет статистических программ SPSS 16.0.

Результаты

Как показало полнотранскриптомное профилирование, из общего числа генов, представленных на микрочипе, более чем 1,41-кратная по модулю дифференциальная экспрессия (|log2FC| ≥0,5) по сравнению с показателем для 1-й группы, вызванная потреблением Q или/и ВУВЖД, во 2, 3 и 4-й группах животных выявлена в общей сложности для 1604 генов (5,35% от общего количества). Во 2-й группе (потребление контрольного рациона с добавкой Q) выявлено 117 (7,3%) уникальных (свойственных только этой группе) генов из общего числа 1396 дифференциально экспрессированных генов, в 3-й группе (потребление ВУВЖД) — 393 (24,5%) гена, в 4-й группе (потребление ВУВЖД и Q) — 391 (24,4%) ген. Одновременно только во 2-й и 3-й группах отмечалась дифференциальная экспрессия 34 (2,1%) генов, во 2-й и 4-й группах — 29 (1,8%) генов, в 3-й и 4-й группах — 539 (33,6%) генов (рис. 1, а). Сразу во всех трех экспериментальных группах животных дифференциально экспрессированным в сравнении с 1-й группой был 101 (6,3%) ген. В табл. 1 приведен перечень кратких международных символов генов, для которых выявлена наибольшая положительная дифференциальная экспрессия, а в табл. 2 — тех, для которых дифференциальная экспрессия была отрицательной.

 

Таблица 1. Список генов с наибольшей положительной дифференциальной экспрессией, вызванной потреблением опытных рационов при уровне значимости р≤0,05 для крыс 2, 3 и 4-й групп (в сравнении с 1-й группой, получавшей сбалансированный полусинтетический рацион)*

Группа

Экспрессия, |log2FC|

+>1

+0,7–1

+0,5–0,7

2-я

LOC102549203

Sult1c3

Defb17

Car3

LOC102556574

Isg15

Nat8

Tsku

LOC102549099

Cml2

Socs2

Pkib

Zswim5

Rgs3

Tac3

Slc25a30

Onecut1

LOC103693809

LOC102548450

Per1

Crygd

Grin3a

Sult1e1

Cry1

Kcnip1

LOC102547221

Ctgf

LOC100909643

3-я

Cyp2c11

Ppp1r3b

Ltbp2

Gfra1

Ip6k2

Rup2

LOC100912658

LOC103690477

Cth

Slfn4

Heph

Arhgap22

Slc6a6

Nipal2

Nmt2

Comp

Myzap

Gria3

Dcn

Acsm3

Zbtb16

LOC102551151

Cd274

LOC102555870

Spp1

Ch25h

Hnrnpa2b1

Ccdc68

LOC102552977

Cystm1

4-я

Ubd

Dcn

Itga4

Btnl5

Hmgb1

Fam180a

Abcb1b

LOC685067

Trim30

G6pc

Cldn23

Ube2c

RT1-CE5

Rhoc

Tspo2

Rbm25

Zswim5

Flvcr2

Lpl

Usp2

Slpil3

Nol3

Cox6a2

Fam105a

Rrm2

Comp

LOC102551574

A2m

Ddit4l2

Ppp1r3b

Гены с положительной экспрессией, общие для групп:

2-й и 3-й

Onecut1, Gck, Defb17, LOC102549099, Cry1, MGC108823, Gcnt4, Apol9a, LOC102552977, Slc6a7

2-й и 4-й

Pcdh19, Zswim5, Grin3a, Lzts3, A2m, Lhfpl4, Bicc, LOC103690085, Pkib, LOC102547637

3-й и 4-й

Tsx, Sds, Sdr16c6, Scd2, Stac3, Cyp2c12, LOC100366030, Cyp2c24, Aldh1b1, LOC102549932

2-й, 3-й и 4-й

LOC102555663, Cdh17, Oasl, LOC103693974, Cox6a2, Cyp7b1, LOC102552001, Sult1c3, Tsku, Smoc2

Примечание. * — В каждой группе представлено до 10 генов с наибольшей дифференциальной экспрессией.

 

Таблица 2. Список генов с наибольшей (по модулю) отрицательной дифференциальной экспрессией, вызванной потреблением опытных рационов при уровне значимости р≤0,05 для крыс 2, 3 и 4-й групп (в сравнении с 1-й группой, получавшей сбалансированный полусинтетический рацион)*

Группа

Экспрессия, |log2FC|

<–1

(–1)–(–0,7)

(–0,5)–(–0,7)

2-я

Olr292

Rgs4

Slc7a2

Wfdc11

Lhx8

Kcnj15

Hsd3b5

Ppef2

Nucb2

Kcnk5

LOC103690608

LOC103694173

LOC100360128

LOC102552001

LOC691485

Slc39a5

Trpm8

Ccnb2

Olr1353

Zfp90

Upp2

RGD1309540

Tmem179

RGD1561517

Adcy10

3-я

Fmo1

Rgs4

Pdhb

Samd15

Wfdc11

Slc13a5

Tmem179

Hsd3b5

LOC102555010

Bmp7

Nucb2

Slc16a11

Slc2a5

LOC103694173

Agpat3

Tas1r1

Trpm8

LOC103692524

LOC691485

Olr1353

LOC108348296

Rgs12

LOC102552001

Appl2

Cacnb4

RGD1309540

Cyp26a1

 

RGD1561517

LOC103692812

4-я

LOC103692325

Dnajc5b

Lipe

Olr1583

Bmp7

Galt

Prtg

Lamb3

Srd5a1

Col9a2

LOC501346

Mcpt8

Ppef2

LOC102551647

Tp53i13

LOC102552469

RGD1564786

Pdzd7

Cib2

LOC102552306

Fpr1

Mt1

LOC102551879

Taf1d

Acot1

LOC691485

Slc25a47

LOC10255627

Cacnb4

Retnlg

Гены с отрицательной экспрессией, общие для групп:

2-й и 3-й

LOC108349355, Ptprs, LOC100911949, Plekha6, Fnip2, Slc25a29, Derl2, LOC103690779, Lpal2, LOC102547508

2-й и 4-й

Ino80. LOC100911891, Nr0b2, LOC102550442, LOC103694148, Slc7a2, Shank2, RGD1564786

3-й и 4-й

Hfe2, Olr1583, Afg1l, LOC102551374, LOC102547136, Lpar2, Rhobtb3, Palm, Sh3d21, Coq10a

2-й, 3-й и 4-й

Cpt1a, Fut8, Zfp266, Scgb1a1, Dtx1, Mrnip, Agfg2, Cpeb3, Sdr42e1, Wwox

Примечание. * — В каждой группе представлено до 10 генов с наибольшей дифференциальной экспрессией.

 

Рис. 1. Диаграммы Венна.

а — распределения дифференциально экспрессированных ((|log2FC| ≥ 0,5) генов в опытных группах крыс Zucker-LEPRfa 2, 3 и 4-й в сравнении с 1-й группой; б — распределения генов, дифференциально экспрессированных ((|log2FC| ≥ 0,5) в ответ на потребление кверцетина у крыс вышеуказанной линии, в 4-й группе в сравнении с группами 1-й и 3-й и во 2-й группе в сравнении с 1-й группой.

 

Представляло интерес также установление генов, отвечающих дифференциальной экспрессией на потребление собственно Q при различных пищевых режимах. Для этого была дополнительно просчитана дифференциальная экспрессия генов в 4-й группе в сравнении с 3-й группой, и полученное множество соотнесено с множествами генов, дифференциально экспрессированных в 4-й группе и во 2-й группе в сравнении с 1-й группой. Общее число таких генов составило 1396 (см. рис. 1, б). При этом число генов, ответивших на потребление Q во всех случаях (т.е. независимо от потребления ВУВЖД, либо контрольного рациона), составило 15.

На рис. 2 на цв. вклейке представлены диаграммы рассеяния («volcano plots») в координатах: логарифм дифференциальной экспрессии гена (log2FC); минус логарифм вероятности (–lg(p) нуль-гипотезы данного эффекта для всех изученных генов, качественно демонстрирующие степень влияния применяемых экспериментальных рационов на транскриптом. Потребление ВУВЖД животными 3-й и 4-й групп сопровождается наибольшей дисперсией (в сторону как положительной, так и отрицательной дифференциальной экспрессии) транскриптома, тогда как эффект Q на стандартном рационе оказывается значительно менее выраженным.

 

Рис. 2. Диаграммы рассеяния «Volcano plots» дифференциальной экспрессии генов в группах животных 2 (а), 3 (б) и 4 (в) в сравнении с 1-й группой.

Ось абсцисс — двоичный логарифм дифференциальной экспрессии гена (FC), ось ординат — минус десятичный логарифм статистической значимости эффекта (p). Заливкой (цветом) выделены гены, находящиеся в квадрантах |log2FC|>1; –lg(p) >1,301 (p<0,05).

 

Анализ профилей дифференциальной экспрессии генов по отдельным группам животных в среде “R” позволил выявить наборы метаболических путей, являющихся мишенями применяемых рационов. Распределение (в виде диаграммы Венна) по группам животных метаболических путей, изменившихся в зависимости от всех опытных пищевых режимов, при сравнении с 1-й группой, приведено на рис. 3.

 

Рис. 3. Диаграмма Венна распределения по группам крыс Zucker-LEPRfa метаболических путей, являющихся мишенями применявшихся диетических воздействий.

 

Из числа выявленных, 7 метаболических путей были затронуты во всех трех опытных группах животных. Это были такие метаболические пути, как:

— rno00830 Retinol metabolism (метаболизм производных ретинола);

— rno00140 Steroid hormone biosynthesis (биосинтез стероидных гормонов);

— rno00591 Linoleic acid metabolism (метаболизм линолевой кислоты);

— rno04976 Bile secretion (секреция желчи);

— rno00982 Drug metabolism — cytochrome P450 (метаболизм лекарственных препаратов системой цитохромов Р450);

— rno00590 Arachidonic acid metabolism (метаболизм арахидоновой кислоты);

— rno00980 Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 (метаболизм ксенобиотиков системой цитохромов Р450).

Помимо этого, общими для 3-й и 4-й групп, получавших ВУВЖД, были 10 изменившихся метаболических путей. Только в 3-й группе (ВУВЖД) модифицировался один, а в 4-й группе (ВУВЖД+Q) — 5 метаболических путей.

Анализ изменений в 7 общих для всех пищевых режимов метаболических путей крыс Zucker-LEPRfa показал, что эти изменения под действием ВУВЖД и/или Q различаются. Пример этих изменений для метаболического пути Steroid hormone biosynthesis (rno00140) представлен на рис. 4 на цв. вклейке (см. раздел Дополнительная информация).

Модификации метаболического пути Retinol metabolism (rno00830) включали такие эффекты, как угнетение транскрипции DHRS4 (Dehydrogenase/reductase SDR family member 4) и RDH (retinol dehydrogenase) при потреблении ВУВЖД. Q (4-я группа) частично отменял первый из этих эффектов. Изменения в метаболическом пути Drug metabolism — cytochrome P450 (rno00982) под действием применявшихся диетических режимов заключались в увеличении под действием Q экспрессии моно аминооксидазы (КФ 1.4.3.4.), снижении глутатион-S-трансферазы (КФ 2.5.1.18), причем эти эффекты были в основном противоположными наблюдаемым при действии ВУВЖД.

 

Рис. 4. Сравнительные изменения в метаболическом пути STEROID HORMONE BIOSYNTHESIS у крыс Zucker-LEPRfa группы 2 (а) в сравнении с 1-й группой.

 

Рис. 4. Сравнительные изменения в метаболическом пути STEROID HORMONE BIOSYNTHESIS у крыс Zucker-LEPRfa группы 3 (б) в сравнении с 1-й группой.

 

Рис. 4. Сравнительные изменения в метаболическом пути STEROID HORMONE BIOSYNTHESIS у крыс Zucker-LEPRfa группы 4 (в) в сравнении с 1-й группой.

 

Особо следует также отметить, что, в отличие от крыс 2-й группы, потребление ВУВЖД крысами 3-й и 4-й групп приводило к модификации PPAR-сигнального (rno 03320) пути в сравнении с 1-й группой. При этом добавка Q на фоне ВУВЖД (4-я группа) возвращала показатели дифференциальной экспрессии ряда ферментов этих метаболических путей (КФ 2.1.1.245, КФ 4.2.3.140, PGAR, PDK1, faBP, AQP1, MRP4, PKA, ABCG8) к нейтральному уровню.

Как следует из данных, представленных на рис. 5, у крыс линии Zucker-LEPRfa, получавших ВУВЖД, отмечалось значимое (p<0,05) повышение уровня общего кальция и фосфора в плазме по сравнению с животными, получавшими контрольный сбалансированный рацион, независимо от присутствия Q в составе диеты.

 

Рис. 5. Уровни общего кальция и фосфора в плазме крови крыс Zucker-LEPRfa 1–4-й групп при выведении из эксперимента.

 

Анализ относительной экспрессии 7 генов методом ОТ-ПЦР в реальном времени (рис. 6) выявил различные воздействия со стороны применявшихся рационов. Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA и/или критерий Краскелла–Уоллиса) для 1–4-й групп показал, что повышенная квота жира и фруктозы в рационе животных значимо (p<0,05) влияла на уровни мРНК Prom1, GAPDH и FTO, тогда как добавка Q — на UGT2b37 и Prdx1. Кроме того, для генов NpY и Crot было выявлено совместное влияние ВУВЖД и Q. Усиление под влиянием ВУВЖД экспрессии Prom1, GAPDH и FTO наблюдалось только у крыс, не получавших Q.

 

Рис. 6. Изменения в экспрессии генов Сrot, FTO, NpY, Prdx1, Prom1, Ugt2b37, GAPDH в печени крыс Zucker-LEPRfa по данным ОТ ПЦР.

Ось абсцисс — группы животных (см. легенду к рисунку), ось ординат — логарифм по основанию 2 экспрессии, нормированный на уровень мРНК β-актина. Стрелки — различие между группами достоверно p<0,05; непараметрический U-тест Манна–Уитни.

 

Обсуждение

Анализ изменений, наблюдавшихся у крыс в метаболическом пути Steroid hormone biosynthesis (rno00140), показал, что во 2-й группе (потребление Q на фоне сбалансированного рациона) отмечается значительное подавление экспрессии гена UGT2B7, (УДФ-глюкуронозилтрансфераза, КФ 2.4.1.17). Функцией этого фермента является присоединение остатка глюкуроновой кислоты к стероидным гормонам (и другим гидрофобным метаболитам), что способствует их экскреции с мочой. В результате этого возможно возрастание в циркуляции концентраций тестостерона, 2-метокси- и 2-гидроксиэстрадиола-17β-эстрона, 2-метоксиэстрона и др. В отличие от этого, у животных 3-й группы экспрессия UGT2B7 значительно повышена (log2FC>2), а в 4-й группе эти эффекты, по-видимому, взаимно нейтрализуются. Другим геном, затронутым в рамках данного метаболического пути, является CYP17A1(стероид-17α-монооксигеназа, КФ 1.14.14.19). Этот фермент системы цитохромов Р-450 осуществляет 17α-гидроксилирование стероидов. Из данных, приведенных на рис. 4, видно, что Q на фоне стандартного рациона значимо не влияет на его экспрессию. ВУВЖД значительно подавляет экспрессию данного фермента, что не отменяется добавкой Q (4-я группа). Биологические последствия этого эффекта могут состоять в том, что вследствие метаболического блока взаимопревращения кортизола и его неактивного предшественника кортикостерона возможно опосредованное влияние на минеральный обмен, в частности, на уровни Ca и P. Действительно, у крыс 3-й и 4-й групп были повышены уровни кальция и фосфора в плазме в сравнении с 1-й группой, причем Q значимым образом не влиял на изменения этих показателей (см. рис. 5). Одновременно крысы 4-й группы, получавшие ВУВЖД и Q, характеризовались меньшим уровнем краткосрочной памяти и повышенной тревожностью в тесте условного рефлекса пассивного избегания, в сравнении с 1-й контрольной группой [17], что может быть объяснено усилением стресса у этих животных, вызванным нарушениями в метаболизме кортизола.

Экспрессия изозима 2 11β-дегидрогеназы кортикостероидов (КФ:1.1.1.145) значимо не менялась под действием Q на контрольном рационе. ВУВЖД вызывал значительное усиление экспрессии (log2FC>1) независимо от потребления Q. Последствиями этого эффекта может быть метаболический блок, приводящий к накоплению 11-дегидрокортикостерона и далее 3α, 20α,21α-тригидро-5β-прегнан-11,20-диона.

Экспрессия катехол-O-метилтрансферазы (КФ 2.1.1.6) выраженно подавляется Q (log2FC<–1), тогда как эффект ВУВЖД отсутствует. Снижение экспрессии этого многофункционального фермента, переносящего метильную группу от S-аденозилметио нина на различные субстраты (катехол, адреналин, норадреналин, стероиды), приводит к блокаде образования 2-метоксиэстрадиола-17β, а также, возможно, снижает уровень активных форм катехоламинов, что может быть соотнесено с выявленным ранее снижением показателя подвижности (локомоторной активности) крыс Zucker-LEPRfa под действием Q в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» [17].

Экспрессия гена CYP11B1, кодирующего стероидную 11β-монооксигеназу (КФ 1.4.15.4), аналогично некоторым другим генам семейства цитохрома Р-450 значимо подавляется при потреблении ВУВЖД (что соответствует данным литературы [18]), тогда как Q (4-я группа) ослабляет эффект только частично. Это может усиливать блокаду образования кортикостерона с соответствующими влияниями на минеральный обмен (см. рис. 5). Важно отметить также, что данный фермент является ключевым фактором, обеспечивающим связь обмена глюкокортикоидов (взаимопревращения кортизола и кортизона) с уровнями цитокинов и Lep [19], нарушенная рецепция которого является главной чертой фенотипа крыс Zucker-LEPRfa. Активность CYP11B1 в печени отрицательно коррелировала с уровнем циркулирующего Lep и его растворимого рецептора [20].

Следствием изменений в метаболическом пути Retinol metabolism (rno00830) у крыс подопытных групп может быть развивающийся при ожирении метаболический блок образования 9-цис-ретиноевой кислоты, сопровождаемый активацией множественных ядерных транскрипционных факторов. Изменение экспрессии UGT2B7 в контексте метаболизма ретиноидов должно было приводить к усилению глюкуронирования (и клиренса) all-trans ретиноевой кислоты. Q и ВУВЖД оказывали противоположное действие и на экспрессию лецитин-ретинол ацилтрансферазы (КФ 2.3.1.135), следствием чего могло быть увеличение уровней эфира ретинола за счет его свободной формы при потреблении ВУВЖД, частично отменяемое Q. При ожирении данный эффект может снижать действие витамина А даже при его нормальном поступлении с пищей. Между ожирением, уровнем Lep и нарушениями метаболизма ретинола и его производных существует прямая связь [21].

В рамках данного метаболического пути меняется и экспрессия ряда ферментов системы цитохрома Р-450 (CYP3A, CYP4A1 и др.), причем эффекты ВУВЖД и Q на эти звенья метаболизма ретиноидов в большинстве случаев противоположны. Активизация экспрессии CYP3A, наблюдаемая при потреблении ВУВЖД у крыс Zucker-LEPRfa, согласуется с известными данными о повышении активности этой изоформы P450 при ожирении [22].

Изменения экспрессии ряда ключевых генов углеводно-энергетического обмена, системы детоксикации ксенобиотиков, поддержания редокс-гомео стаза были выявлены у крыс Zucker-LEPRfa, получавших ВУВЖД и его комбинацию с Q при использовании таргетной ПЦР-ОТ отдельных нуклеотидных последовательностей. В числе этих дифференциально экспрессированных генов идентифицирован GAPDH, отвечающий за обратимое окислительное фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфата в присутствии неорганического фосфата и NAD [23]. Ген Prom1 кодирует рецептор CD133 (проминин), являющийся маркером гематопоэтических клеток [24].Потребление ВУВЖД также потенцирует экспрессию «гена ожирения» FTO (α-кетоглутаратзависимой деметилазы нуклеиновых кислот), участвующего в эпигенетической регуляции метаболических процессов [25].

Отрицательная дифференциальная экспрессия гена Ugt2b37 (изоформа УДФ-глюкуронозилтранс феразы) под действием Q во 2-й и 4-й группах может свидетельствовать о снижении функции детоксикации эндогенных гидрофобных метаболитов, включая липиды, гиперпродукция которых может протекать на фоне жировой дегенерации печени [26]. Важно отметить, что данный результат качественно согласуется с данными полнотранскриптомного профилирования.

Пероксиредоксин, кодируемый геном Prdx1 (тиолзависимой пероксидазы, регулятора внутриклеточного Red/Ox гомеостаза), участвует в окислительно-восстановительной регуляции клетки и играет важную роль в устранении пероксидов, образующихся в процессах метаболизма, регулируя внутриклеточные концентрации H2O2. Также белок может разрушать внутримолекулярную дисульфидную связь в GDPD5 (глицерофосфодиэфирный фосфодиэстеразный домен 5), которая обеспечивает способность GDPD5 управлять дифференцировкой постмитотических моторных нейронов [27]. Уровень экспрессии гена Prdx1 у крыс, получавших Q на фоне ВУВЖД, был повышен в 2 раза в сравнении с контролем. Таким образом, можно предположить прямое влияние Q на экспрессию гена, кодирующего пероксиредоксин, при повышенном количестве пероксидов, образующихся в ходе перекисного окисления липидов на фоне потребления насыщенного жирами ВУВЖД.

Экспрессия гена орексигенного нейропептида NpY, отвечающего у грызунов за гиперфагию и развитие ожирения [28], достоверно подавляется при потреблении ВУВЖД, а Q, по-видимому, отменяет этот эффект. Причем в отличие, например, от гипоталамуса, подобный эффект дифференциальной транскрипции гена NpY в ткани печени был обнаружен впервые. Экспрессия гена NpY у крыс, склонных к развитию алиментарного ожирения, находится под контролем эпигенетических факторов [29].

Фермент карнитин-октаноилтрансфераза, кодируемый геном Crot, катализирует обратимый перенос ацильных групп жирных кислот между коэнзимом А и карнитином, что обеспечивает транспортировку средне- и длинноцепочечных молекул ацил-CoA из пероксисом в цитозоль и митохондрии [30]. Повышение уровня экспрессии этого гена в 3-й и 4-й группах позволяет предположить сопряженную с циклом Кребса активацию процессов β-окисления жирных кислот в митохондриях под действием избыточных количеств экзогенных жиров, получаемых с ВУВЖД.

Заключение

На модели крыс самцов Zucker-LEPRfa, генетически склонных к развитию ожирения вследствие нарушенной рецепции лептина, показано, что Q или/и ВУВЖД значимо меняют уровни транскрипции 1604 генов в ткани печени, из которых эффект собственно Q проявляется для 1396 генов. Изменения в транскриптоме ткани печени, вызываемые ВУВЖД, выражены значительнее, чем обусловленные добавкой Q на фоне стандартного рациона. С помощью количественной ПЦР-ОТ установлено, что Q влияет на экспрессию генов, отвечающих за процессы детоксикации ксенобиотиков (UGT2b37), редокс-гомеостаз (Prdx1), бета-окисления жирных кислот (Crot) и центральные механизмы регуляции чувств голода и насыщения (NpY), а также потенцирует, либо отменяет эффекты ВУВЖД в отношении ряда других функционально значимых генов. Биоинформатический анализ выявил влияние потребления ВУВЖД и/или Q на 23 метаболических пути (KEGGS), из которых 7 [метаболизм стероидов, арахидоновой и линолевой кислот, ретиноидов, лекарственных препаратов и ксенобиотиков (под действием цитохрома Р-450), секреции желчи] были затронуты во всех под опытных группах. Изменения в транскриптоме печени крыс Zucker-LEPRfa, вызванные потреблением ВУВЖД и/или Q, согласуются с экспериментальными данными об изменении показателей краткосрочной памяти, тревожности и минерального обмена у этих животных. Выявленные при анализе дифференциальной экспрессии генов ключевые маркеры путей метаболизма стероидов, арахидоновой и линолевой кислот, ретиноидов, лекарственных препаратов и ксенобиотиков (под действием цитохрома Р-450), и секреции желчи могут быть использованы при доклинических испытаниях фармакологических препаратов и специализированных функциональных пищевых продуктов, предназначенных для коррекции обменных нарушений при ожирении.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант РНФ № 17-16-01043).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: полнотранскриптомный анализ на микрочипе — Н.В. Трусов; разработка дизайна эксперимента, проведение ПЦР в режиме реального времени, написание статьи (разделы «Методы», «Результаты») — С.А. Апрятин; проведение биоинформатического анализа — А.Ю. Горбачев, В.А Наумов.; работа с животными, выделение мРНК из ткани печени, проведение обратной транскрипции — К.В. Мжельская; разработка общей концепции исследования, сбор и анализ данных литературы, статистическая обработка и интерпретация данных, написание статьи (разделы «Введение», «Обсуждение», «Заключение») — Гмошинский И.В. Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией.

Благодарности. Авторы благодарят к.м.н., главного специалиста ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Хорхе Селада Сото за предоставленные данные биохимического исследования плазмы крови.

About the authors

Nikita V. Trusov

Federal Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Email: nikkitosu@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1919-9297
SPIN-code: 5182-2665

Russian Federation, 2/14, Ustinskiy proezd, Moscow, 109240

senior researcher laboratory of food enzymology 

Sergey A. Apryatin

Federal Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Email: apryatin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6543-7495
SPIN-code: 4250-2758

Russian Federation, 2/14, Ustinskiy proezd, Moscow, 109240

PhD

Aleksey Yu. Gorbachev

Federal Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Email: augorbachev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2743-5835
SPIN-code: 3630-9218

Russian Federation, 2/14, Ustinskiy proezd, Moscow, 109240

PhD

Vladimir A. Naumov

National Medical Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: looongdog@gmail.com
SPIN-code: 9218-7997

Russian Federation, 4, akademika Oparina street, Moscow, 117997

researcher

Kristina V. Mzhelskaya

Federal Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Email: kristik13@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0723-5860
SPIN-code: 8608-1400

Russian Federation, 2/14, Ustinskiy proezd, Moscow, 109240

postgraduate laboratory of food enzymology 

Ivan V. Gmoshinski

Federal Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Author for correspondence.
Email: gmosh@ion.ru
ORCID iD: 0000-0002-3671-6508
SPIN-code: 4501-9387
http://www.ion.ru

Russian Federation, 2/14, Ustinskiy proezd, Moscow, 109240

PhD

References

  1. Deck CA, Honeycutt JL, Cheung E, et al. Assessing the functional role of leptin in energy homeostasis and the stress response in vertebrates. Front Endocrinol (Lausanne). 2017;8:63. doi: https://doi.org/10.3389/fendo.2017.00063
  2. Hsu TM, Hahn JD, Konanur VR, et al. Hippocampus ghrelin signaling mediates appetite through lateral hypothalamic orexin pathways. Elife. 2015;4. doi: https://doi.org/10.7554/elife.11190
  3. Bojanowska E, Ciosek J. Can we selectively reduce appetite for energy-dense foods? An overview of pharmacological strategies for modification of food preference behavior. Curr Neuropharmacol. 2016;14(2):118-142. doi: https://doi.org/10.2174/1570159x14666151109103147
  4. Ouchi N, Parker Jl, Lugus Jj, Walsh K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 2011;11(2):85-97. doi: https://doi.org/10.1038/nri2921
  5. Londraville RL, Prokop JW, Duff RJ, et al. On the molecular evolution of leptin, leptin receptor, and endospanin. Front Endocrinol (Lausanne). 2017;8:58. doi: https://doi.org/10.3389/fendo.2017.00058
  6. Pedroso JA, Silveira MA, Lima LB, et al. Changes in leptin signaling by Socs3 modulate fasting-induced hyperphagia and weight regain in mice. Endocrinology. 2016;157(10):3901-3914. doi: https://doi.org/10.1210/en.2016-1038
  7. Schaab M, Kratzsch J. The soluble leptin receptor. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2015;29(5):661-670. doi: https://doi.org/10.1016/j.beem.2015.08.002
  8. Lopez-Jaramillo P, Gomez-Arbelaez D, Lopez-Lopez J, et al. The role of leptin/adiponectin ratio in metabolic syndrome and diabetes. Horm Mol Biol Clin Investig. 2014;18(1):37-45. doi: https://doi.org/10.1515/hmbci-2013-0053
  9. Perez-Perez A, Vilarino-Garcia T, Fernandez-Riejos P, et al. Role of leptin as a link between metabolism and the immune system. Cytokine Growth Factor Rev. 2017;35:71-84. doi: https://doi.org/10.1016/j.cytogfr.2017.03.001
  10. Kobori M, Masumoto S, Akimoto Y, Oike H. Chronic dietary intake of quercetin alleviates hepatic fat accumulation associated with consumption of a western-style diet in C57/Bl6J mice. Mol Nutr Food Res. 2011;55(4):530-540. doi: https://doi.org/10.1002/mnfr.201000392
  11. Panchal SK, Poudyal H, Brown L. Quercetin ameliorates cardiovascular, hepatic, and metabolic changes in diet-induced metabolic syndrome in rats. J Nutr. 2012;142(6):1026-1032. doi: https://doi.org/10.3945/jn.111.157263
  12. Edwards RL, Lyon T, Litwin SE, et al. Quercetin reduces blood pressure in hypertensive subjects. J Nutr. 2007;137(11):2405-2411. doi: https://doi.org/10.1093/jn/137.11.2405
  13. Castrejon-Tellez V, Rodriguez-Perez JM, Perez-Torres I, et al. The effect of resveratrol and quercetin treatment on PPAR mediated uncoupling protein (UCP–) 1, 2, and 3 expression in visceral white adipose tissue from metabolic syndrome rats. Int J Mol Sci. 2016;17(7). doi: https://doi.org/10.3390/ijms17071069
  14. Agilent Total Rna Isolation Mini Kit Protocol. 5th Ed. 2015.
  15. One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis Low Input Quick Amp Labeling. 2015.
  16. Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Statist Soc B. 1995;57(1):289-300.
  17. Mzhel’skaya KV, Shipelin VA, Shumakova AA, et al. Effects of quercetin on neuromotor function and behavioral responses of the Zucker rats on a high-fat and highcarbohydrate diet. In: Proceedings of the 25th multidisciplinary international neuroscience and biological psychiatry conference «Stress, Brain and Behavior». Saint-Petersburg, 16—18 May 2018. Saint-Petersburg. 2018;41.
  18. Tomankova V, Anzenbacher P, Anzenbacherova E. Effects of obesity on liver cytochromes P450 in various animal models. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2017;161(2):144-151. doi: https://doi.org/10.5507/bp.2017.026
  19. Mattsson C, Rask E, Carlstrom K, et al. Gender-specific links between hepatic 11beta reduction of cortisone and adipokines. Obesity (Silver Spring). 2007;15(4):887-894. doi: https://doi.org/10.1038/oby.2007.587
  20. Tomlinson JW, Stewart PM. The functional consequences of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase expression in adipose tissue. Horm Metab Res. 2002;34(11-12):746-751. doi: https://doi.org/10.1055/s-2002-38242
  21. Jeyakumar SM, Vajreswari A. Vitamin A as a key regulator of obesity and its associated disorders: evidences from an obese rat model. Indian J Med Res. 2015;141(3):275-284. doi: https://doi.org/10.4103/0971-5916.156554
  22. Chen HW, Tsai CW, Yang JJ, et al. The combined effects of garlic oil and fish oil on the hepatic antioxidant and drug-metabolizing enzymes of rats. Br J Nutr. 2003;89(2):189-200. doi: https://doi.org/10.1079/bjn2002766
  23. Burke JR, Enghild JJ, Martin ME, et al. Huntingtin and DRPLA proteins selectively interact with the enzyme GAPDH. Nat Med. 1996;2(3):347-350. doi: https://doi.org/10.1038/nm0396-347
  24. Torrente Y, Belicchi M, Sampaolesi M, et al. Human circulating AC133(+) stem cells restore dystrophin expression and ameliorate function in dystrophic skeletal muscle. J Clin Invest. 2004; 114(2):182-195. doi: https://doi.org/10.1172/jci20325
  25. Boissel S, Reish O, Proulx K, et al. Loss-of-function mutation in the dioxygenase-encoding FTO gene causes severe growth retardation and multiple malformations. Am J Hum Genet. 2009;85(1):106-111. doi: https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2009.06.002
  26. Beaulieu M, Levesque E, Hum DW, Belanger A. Isolation and characterization of a novel CDNA encoding a human UDP-glucuronosyltransferase active on C19 steroids. J Biol Chem. 1996;271(37): 22855-22862. doi: https://doi.org/10.1074/jbc.271.37.22855
  27. Hirotsu S, Abe Y, Okada K, et al. Crystal structure of a multifunctional 2-Cys peroxiredoxin heme-binding protein 23 KDA/Proliferation-associated gene product. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96(22):12333-12338. doi: https://doi.org/10.1073/pnas.96.22.12333
  28. Vahatalo LH, Ruohonen ST, Ailanen L, Savontaus E. Neuropeptide Y in noradrenergic neurons induces obesity in transgenic mouse models. Neuropeptides. 2016;55:31-37. doi: https://doi.org/10.1016/j.npep.2015.11.088
  29. Kim YJ, Bi S. Knockdown of neuropeptide Y in the dorsomedial hypothalamus reverses high-fat diet-induced obesity and impaired glucose tolerance in rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2016;310(2):R134-R142. doi: https://doi.org/10.1152/ajpregu.00174.2015
  30. Ferdinandusse S, Mulders J, L IJ, et al. Molecular cloning and expression of human carnitine octanoyltransferase: evidence for its role in the peroxisomal beta-oxidation of branched-chain fatty acids. Biochem Biophys Res Commun. 1999;263(1):213-218. doi: https://doi.org/10.1006/bbrc.1999.1340

Supplementary files

Supplementary Files Action
1.
Fig. 1. Venn diagrams.

View (153KB) Indexing metadata
2.
Fig. 2. Scatter charts “Volcano plots” of differential gene expression in groups of animals 2 (a), 3 (b) and 4 (c) in comparison with the 1st group.

View (751KB) Indexing metadata
3.
Fig. 3. Venn diagram of distribution of Zucker-LEPRfa rats of metabolic pathways, which are the targets of the dietary effects used.

View (70KB) Indexing metadata
4.
Fig. 4. Comparative changes in the metabolic pathway of STEROID HORMONE BIOSYNTHESIS in rats Zucker-LEPRfa group 2 (a), in comparison with the 1st group.

View (770KB) Indexing metadata
5.
Fig. 4. Comparative changes in the metabolic pathway of STEROID HORMONE BIOSYNTHESIS in Zucker-LEPRfa group 3 (b) rats in comparison with the 1st group.

View (769KB) Indexing metadata
6.
Fig. 4. Comparative changes in the metabolic pathway of STEROID HORMONE BIOSYNTHESIS in Zucker-LEPRfa rats of groups 2 (a), 3 (b) and 4 (c) in comparison with the 1st group.

View (763KB) Indexing metadata
7.
Fig. 5. Levels of total calcium and phosphorus in the blood plasma of rats Zucker-LEPRfa 1-4 groups when removed from the experiment.

View (81KB) Indexing metadata
8.
Fig. 6. Changes in the expression of the Сrot, FTO, NpY, Prdx1, Prom1, Ugt2b37, GAPDH genes in the liver of Zucker-LEPRfa rats according to RT PCR data.

View (348KB) Indexing metadata

Statistics

Views

Abstract - 595

PDF (Russian) - 38

Remote (Russian) - 82

Cited-By


PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2019 Trusov N.V., Apryatin S.A., Gorbachev A.Y., Naumov V.A., Mzhelskaya K.V., Gmoshinski I.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies